光交联技术的生物应用研究进展

光交联技术的生物应用研究进展

摘要：光交联反应作为一种快速、简单和时空可控的交联工具广泛地应用于化学、生物、医学和材料等不同研究领域。本文详细介绍了常用的小分子光交联基团的结构、分类及反应机理，重点综述了光交联技术在生物医学领域的应用研究，并对其应用前景进行了展望。目前大多光交联基团仅对紫外和可见光具有敏感性，紫外和可见光穿透力弱、组织吸收强和散射等问题严重限制了该技术在生物体内的应用研究。因此，进一步研究光交联技术在生物体系的应用和开发长波长光（如近红外或远红外光）介导的新交联技术对于药物研发和疾病诊疗具有重要的科学意义。

引 言

光化学反应又称光化作用，一般是指物质在可见光或紫外线照射下，物质分子吸收光子后所引发的化学反应。目前能激活物质分子的光源种类繁多，如红外光、可见光、紫外光、激光等。紫外光一般对光化学反应为有效；红外光由于能量低，只能引起分子化学键的振动扰动，很难引发化学反应的发生；而可见光常常被用作光化学反应的引发剂，通常是以光敏剂作为媒介，间接地将光能转移到一些可见光不敏感的反应中去，进而引起光化学反应的发生。总之，光介导的化学反应具有操作简单、反应速度快、副产物少等优点，符合绿色化学的要求，受到光化学研究者们的广泛青睐。上海峰志仪器有限公司提供253nm、302nm、365nm、395nm紫外交联仪以及450nm、530nm、660nm可见光交联仪。

光交联是光化学反应中目前应用为广泛的一种反应。光交联反应（也称作光亲和标记，photoaffinitylabeling,pal）是指将合成的光敏小分子化合物作为工具探针，在特定波长的光照射下，产生高活性的中间体，与其受体活性部位形成特异性的不可逆共价键结合的化学反应。早在1962年，westheimer等人首先提出光亲和标记技术，至今该技术已取得令人瞩目的发展。由于光交联反应具有速度快、条件简单、适合于原位反应等优点，早主要应用于蛋白质的化学修饰和药物靶标蛋白甄别。之后，光交联反应逐渐被应用于研究蛋白与小分子、生物大分子、蛋白或受体间的相互作用。目前该技术已经成为生物化学家和分子生物学家研究生物体系中空间相邻组分及生物大分子间相互作用的一个重要工具。近年来，随着光学技术与生物医学的不断发展，光交联技术被广泛地应用于化学、生物、材料和医学等领域。

２ 光交联反应基团及其作用机制

常见的光交联基团根据其在光照射下生成活性中间体的不同，大致分为四类：氮宾（nitrenes）类、卡宾（carbenes）类、碳正离子（carbocations）和自由基（radicals）类（如图 １）。目前应用为广泛的光交联基团有苯甲酮、叠氮苯和3三氟甲基3苯基二吖丙啶（３ trifluoromethyl 3 phenyldiaz irine TFMD）。通常理想的光交联基团应具备以下几个特征：（１）具有一定的化学稳定性，耐受普通的化学反应；（２）在自然光中具有合理的稳定性；（３）黑 暗 中 稳 定，在 不 对 样 品 造 成 损 伤（＞３００ｎｍ）的紫外光照下很容易光解；（４）光解后的活性中间体既能与亲核的 XH（Ｘ＝Ｎ，Ｓ，Ｏ）官能团反应，也能与 ＣＨ官能团反应；（５）光解中间体与受体作用得到的产物应该比较稳定，能够耐受分离、纯化和分析等操作.

２．１ 氮宾（nitrnenes）类

芳香叠氮化合物是常见的产生氮宾（nitrnenes）类前体的化合物，也是较常用的光交联基团。它的光化学反应机理为：分子在外来光照射

下，芳环上的叠氮基团会首先形成单线激发态，然后释放出氮气生成氮宾。氮宾可以是单线态的中间体，也可以经系间窜越形成三线态中间体。单线态氮宾可以对CH键或者XH键（Ｘ ＝Ｏ，Ｎ，Ｓ）进行插入反应形成共价键结合的产物，也可以重排为 １氮杂２４６环庚四烯（didehydrozaepine）或者通过系间窜越形成三线态中间体。三线态中间体以自由基形式吸收质子氢生成氨基化合物或形成偶联产物。因此，单线态氮宾具有亲电子活性，是发挥交联作用的主要形式。但是，单线态氮宾只能够稳定存在约100us，随后将迅速重排生成比较稳定的烯亚胺，这种烯亚胺分子的反应活性较弱，只能与亲核性官能团反应（如 ＯＨ、ＮＨ、ＳＨ等）。如果活性位点部分没有亲核性官能团，那就可能迁移到离活性位点较远区域交联，产生非特异性交联。

２．２ 卡宾（carbenees）类

卡宾类分为重氮化合物和双吖丙啶类化合物。重氮化合物与叠氮化合物类似，在紫外光的照射下，重氮基团释放一个 Ｎ２分子，形成卡宾中间体，随后进攻邻近的 Ｃ－Ｈ键，生成一个新的共价键。该卡宾中间体也会进行 Ｗｏｌｆｆ重排，形成烯酮，烯酮再与亲核试剂反应，产生非特异性交联。双吖丙啶基团在黑暗中具有良好的稳定性，同时具有较好的光交联活性。其反应机理：在３５０ｎｍ或 ３６５ｎｍ紫外光的照射下，双吖丙啶基团首先发生共价键断裂，释放出一分子 Ｎ２，随后键电子重排，形成活性的卡宾中间体，插入到邻近的 Ｃ－Ｈ键或者其他杂原子与 Ｈ的共价键中，生成新的共价键。这里形成的卡宾中间体半衰期一般在 ｎｓ级，交联反应非常迅速。

２．３ 碳正离子（carbocations）

除了氮宾类和卡宾类基团外，碳正离子也是具有高活性的光交联基团［１６］。芳香重氮盐化合物就是常用的碳正离子前体。首先，芳香重氮盐化合物在紫外光照射下，释放 Ｎ２形成高活性的芳香正离子中间体，随后插入到邻近的 ＣＨ键或者其他杂原子与 Ｈ的共价键中，形成新的共价键。由于芳香重氮盐化合物上重氮的吸电子性使其在通常条件下非常不稳定，一些研究中通过在芳香环上引入供电子基团来改善化合物的稳定性［１７］。

２．４ 自由基（radicals）类

自由基是光交联反应中另一类非常重要的高活性中间体。苯甲酮类化合物是生成自由基的一类常用的、高效的光交联反应化合物。在紫外光的照射下，苯甲酮基团能够产生活性三线态双自由基，自由基分子不发生重排反应，会与周围的CH键发生反应。如果其周围没有适当的CH键存在，双自由基能够稳定存在１２０μｓ，后回复到初始状态，等待再次被激活［１８］。此外，苯甲酮产生的活性三线态双自由基在质子性溶剂中稳，几乎不与水反应，其标记效率较高，对于光交联标记实验非常有用.

４ 结束语

光交联技术由于其简便、快捷、高效和时空可控等优势目前被广泛地应用于药物筛选、靶标蛋白甄别和生物大分子间作用等研究。随着纳米材料和技术的飞速发展，光交联技术近年来从分子生物学领域逐渐拓展到了纳米材料和医学等领域。然而，由于目前光交联反应源主要以紫外光为主，其穿透力浅，组织损害等问题一定程度上限制了该技术在生物医学领域的深入应用。如何克服前述问题，使用近红外或远红外触发交联反应将是一种新的思路，但由于目前对近红外或远红外光敏感的化学交联反应报道较少，发掘该类化学反应对于合成化学家将是一大挑战。总之，相信不久的将来光交联技术一定会在化学、生物、材料和医学等各个领域有着更为广泛的应用前景。

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Advances in biological application of photo-crosslinking technique.pdf

文献地址：光交联技术的生物应用研究进展 (chineseoptics.net.cn)

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