电洗脱法基本原理和实验方法

电洗脱法基本原理

将电泳分离后含目的DNA片段的琼脂糖切割下来， 装于透析袋中，继续在高电压下电泳，这时目的DNA会从凝胶中电泳出进入透析袋中， 由于DNA分子量大，不能透过透析袋，从而保留于透析袋中。取出透析袋中含DNA的溶液， 进一步用酚、氯仿抽提纯化。

电洗脱法实验方法

（一）透析袋的处理：

1．切取适当长度适析袋。

2．在２％NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸10分钟。

3．弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净透析袋。

（二）电洗脱

1．在长波紫外灯下（300－360nm ）将含目标DNA片段的凝胶条带切下装入透析袋中。

2．向透析袋内加入２ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡。

3．将透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行）， 加入适量缓冲液将透析袋浸没（约６－７mm）。

4．接通电源，150伏电洗，在紫外灯下观察待DNA全部移出凝胶。

5．改变电场方向继续通电1分钟。

6．从透析袋中吸出缓冲液于1－5ml Eppendorf管中。

7．加入1.5倍体积正丁醇，混匀抽提去EB。

8．在台式离心机上高速2分钟。

9．吸去上层，正丁醇溶液。

10．重复7，8，9二次。

11．自下层言DNA的溶液中加入等体积酚氯仿（２个）抽提２次。

12．上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc ２倍体积预冷无水乙醇，于20℃过夜。

13．12000g，4℃下离心10分钟，得DNA沉淀。

14．弃上清，加入70％乙醇洗涤２次后弃干乙醇。

15．加入50μl TE溶解DNA。

16．取10μl DNA溶液加入2μl Loading buffer于0.8％琼脂糖上， 40伏电泳，3小时。

17．在紫外透射仪上观察结果。

18．测定DNA溶液OD260,OD280值。

结果与分析

1．计算DNA回收效率，判断DNA纯度。

2．记录电泳结果

从琼脂糖凝胶（Agaros gel）中回收DNA片段实验步骤

1. 配制TAE电泳缓冲液(10′储存液)，10′加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)。

2. 操作步骤

1) 用1′TAE配制1%琼脂糖凝胶。DNA用合适的酶切。

2) 在胶上选定两个加样孔，分别加入少量(10μl)和大量(50μl )DNA酶切产物，电泳。

3) 电泳结束后用刀片切下含有少量DNA酶切产物的泳道(一般选择位于凝胶的边缘)，在紫外灯下找到目的DNA 带，用刀片切在带的下上下边缘各切一个小口作为标记。注意：含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用加荧光染料，也不用紫外灯照射！

4) 将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置，用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶(尽量不要多余的凝胶)，转移至一个称量过的干净的1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。

5) 按照DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。