紫外线交联和免疫沉淀 （CLIP）

紫外线交联和免疫沉淀 （CLIP）

原则

紫外线（UV）交联是RNA生物化学家用来研究活组织中RNA-蛋白质复合物的经典体外工具。科学家们已经成功地使用CLIP（RNA-蛋白质复合物的交联和免疫沉淀）来鉴定神经元特异性RNA结合蛋白Nova家族的许多靶RNA。随着CLIP技术的发展，科学家们正在试行将其与其他几种感兴趣的RNA结合蛋白一起使用，特别是FMRP和Hu家族。

图1.CLIP的基本原理。暴露于紫外线时，近端蛋白质和RNA之间形成共价键。这些键只发生在直接接触的部位，并保留RNA-蛋白质相互作用。

紫外线（UV）暴露后，相邻蛋白质和核酸之间形成共价键。基于这一特殊原理，CLIP已被开发为使用UV测定RNA-蛋白质复合物体内交联的常用方法。裂解交联细胞后，通过免疫沉淀（IP）分离靶蛋白。为了对逆转录的特异性引物进行测序，RNA接头被转移到3'末端，放射性标记的磷酸盐被连接到5'末端。使用凝胶电泳和膜转移从游离RNA中分离RNA-蛋白质复合物。然后进行蛋白酶K消化以从复合物中去除蛋白质。此步骤在交联位点留下肽，从而鉴定交联核苷酸。将RNA接头连接到5'末端后，通过RT-PCR合成cDNA。后一个cDNA核苷酸通过高通量测序鉴定。将读段映射回转录组可以识别相互作用位点。

程序

图2.CLIP测定的工作流程。

1. 组织的紫外线交联

从小鼠身上收获大脑、脊髓或其他靶组织。将组织放在冰冷的HBSS中，直到收获完成。设置一个500mL的Stericup，取下纤维素过滤器，然后用200μm尼龙网片制作一个锥形过滤器以替换它。所得细胞悬液约为100mL，用于10个大脑。接下来，将组织悬液转移到 50mL 管中，并在 4°C 下以 2500g 离心 5 分钟。 除去上清液并将组织重悬于原始组织体积的约10倍。将悬浮液放入150mm组织培养皿中，并将悬浮液放入紫外交联仪照射400mJ / cm2。交联时，在组织悬浮液下方使用一盘冰块以保持悬浮液低温。

将辐照的悬浮液收集在50mL管中，然后用额外的5mL HBSS洗涤每个板，也收集这种洗涤。在4°C下以2500rpm再次旋转组织5分钟。 将组织重悬于原始组织体积的2倍，并将溶液移液到管中。短暂旋转试管并取出上清液。在-80°C下冷冻直至使用。

2. 珠子制备

移液 100μL 蛋白 A Dynabead 珠溶液。将磁珠放入磁性支架中，用 500μL 1X PXL 捕获和清洗磁珠。再重复洗涤两次。将磁珠重悬于 100μL 的 1X PXL 中，并加入适量的抗 RNA 结合蛋白抗体。在室温下摇动试管30分钟至45分钟，使抗体与磁珠结合。用 1X PXL 清洗珠子三次。

3. 交联裂解液检查

使用 100μL 冰冷的 1X PXL 裂解每 100μL 交联细胞。将裂解物放在冰上10分钟。向每个试管中加入 10μL RNasin 和 10μL RQ1 脱氧核糖核酸酶;在 37°C 下孵育 15 分钟。向溶液中加入 1μL RNase T1 储备液 （1 U/μL）;在37°C孵育10分钟，以1000rpm振荡。接下来，在预冷的微量超速离心机中以 90K 在 4°C 下旋转裂解物 25 分钟。

4. 免疫沉淀

对于免疫沉淀，小心地从沉淀碎片中除去上清液，并将上清液添加到一管制备的珠子中。每 300μL 交联组织使用约 100μL 磁珠。在 4°C 下摇动珠子/裂解物 1 小时。 用 1mL 冰冷的 1X PXL 清洗 3 次，用 1mL 冰冷的 1X PNK+ 清洗两次。

5. 激酶免疫沉淀的RNA

将磁珠重悬于80μL 1X PNK+中，加入5μL P32 γ-ATP（γ-腺苷三磷酸）（>3000Ci/mM）和2μL PNK酶。在37°C的热混合器中孵育，并以1000rpm离心20分钟。通过加入5μL 1mM ATP完成反应。让反应在 37°C 下再继续 5 分钟。 用 1mL 冰冷的 1X PNK+ 清洗珠子四次。将磁珠重悬于30μL 1X PNK+和30μL Novex LDS上样缓冲液中。

6. SDS-PAGE凝胶和转印

加载 2 孔/管的 Novex NuPAGE 10% 双三凝胶。在150V下运行凝胶，直到染料前沿位于凝胶底部。凝胶电泳后，使用Novex湿转印装置将凝胶转移到一块S&S BA-85硝酸纤维素上。转移后，用1X PBS冲洗NC过滤器，并在餐巾纸上轻轻吸干。用保鲜膜包裹膜并暴露在薄膜下。

7. 切出交联的RNA-蛋白质复合物

一般来说，RNA-蛋白质复合物以大约蛋白质和RNA的总分子量运行。使用手术刀刀片切掉这条带子，然后将硝酸纤维素切成小块。将这些碎片放入一个干净的管子中。

8. RNA分离纯化

在1X PK缓冲液中制备4mg / mL蛋白酶K溶液;将该储备液在 37°C 下预孵育 20 分钟以消化任何 RNase。向每管分离的NC片中加入200μL该蛋白酶K溶液;在37°C振荡（1200rpm）孵育20分钟。加入 200μL PK/7 M 尿素缓冲液;在37°C振荡（1200rpm）下再孵育20分钟。

加入 400μL RNA 苯酚和 130μL CHCl3 溶液。涡旋这些管，然后在37°C下以1400rpm振荡（1200rpm）孵育20分钟。接下来，在4°C或室温的微量离心机中全速旋转管10分钟。将每个试管的水相放入干净的试管中，加入 50μL 3M NaOAc、pH 5.2 和 1mL 的 1：1 乙醇和异丙醇混合物。在 −20°C 下沉淀过夜。

9. 核糖核酸连接

在冷离心机中全速旋转RNA30分钟。用 100μL 75% 乙醇洗涤沉淀，然后在 SpeedVac 中干燥沉淀。通过切伦科夫计数在闪烁计数器中计数RNA。使用 T4 RNA 连接酶进行 RNA 连接。

10. 连接RNA的纯化

如上所述旋转、洗涤和干燥 RNA 沉淀。通过闪烁计数器中的Cerenkov计数检查RNA回收率。倒入20%变性聚丙烯酰胺凝胶（1：19双：丙烯酰胺，7M尿素）。将整个连接反应重悬于5μL H 2 O和5μL甲酰胺上样缓冲液中。将重悬的RNA在95°C下加热5分钟，然后将整个溶液上样到凝胶上;使用放射性标记的PhiX标记物来调整RNA的大小。

凝胶电泳后，将凝胶放在一块旧薄膜上，并用保鲜膜包裹。将薄膜放在-80°C下，通常过夜以获得良好的信号。使用曝光的薄膜，切出大于约65nt的RNA。将凝胶切片放入试管中;加入350μL核酸洗脱缓冲液，用1mL注射器柱塞压碎;在热混合器中以 37°C 以 1200rpm 孵育 30 分钟。用切断的P1000，将凝胶浆液转移到已添加1cm玻璃预过滤器的色谱柱中。在微量离心机中全速旋转色谱柱，取出流通物并将其放入干净的管中。加入 1mL 1：1 乙醇和异丙醇混合物以及 2μL 糖原（20mg/mL 原液），并在 −20°C 下沉淀过夜。

11. cDNA 和 PCR

如上所述旋转、洗涤和干燥 RNA;在闪烁计数器中再次计数RNA以定量产量。将纯化的RNA重悬于9μL H 2 O中，并以5pmol/μL加入2μL DP3。在65°C加热5分钟;放松和快速旋转。将RNA逆转录成cDNA，并进行PCR扩增。

倒入10%变性聚丙烯酰胺凝胶，并在凝胶上运行约10μL的PCR反应;使用放射性标记的标记物和放射自显影凝胶。剪掉大约 60-100nt 的主要波段（如果有的话，还可以切掉 100nt 及以上）。像上面对RNA所做的那样纯化和沉淀DNA，但让DNA从粉碎的凝胶浆液中洗脱至少4小时。沉淀后，将纯化的DNA重悬于5–10μL水中。

12. TOPO克隆和测序

我们又使用了三到四轮PCR（如果您的次PCR产量较低，则可以使用更多）。使用离心柱对反应进行脱盐。然后，生成 3' A 端。在72°C孵育20分钟;放在冰上，立即用于TOPO克隆反应。轻轻混合并在室温下孵育 5 分钟（储存 3μL，在 −20°C 下进行天克隆时不使用，以进行潜在的后续转化）。按照 TOPO 克隆试剂盒的建议转化大肠杆菌。像其他测序反应一样对单个转化体进行小型制备和测序。

13. 数据库搜索

如果不能识别CLIP标签的亲本RNA，那么CLIP实验就毫无用处。美国生物技术信息中心 （NCBI） 现在有一个专门的 BLAST 搜索页面，供那些寻找简短、几乎完全匹配的人使用，它非常适合 CLIP 标签识别。

本文由谷歌翻译软件自动翻译，原文请浏览www.creativebiomart.net/resource/principle-protocol-crosslinking-and-immunoprecipitation-clip-388.htm