荧光显微镜的原理使用方法和注意事项

荧光显微镜工作原理

多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。

1．激发滤板根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，提供一定波长范围的激发光。
紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。
紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300～450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫蓝光激发滤板：它可使350～490nm的光通过。常用型号为QB24（BG12）。
zui大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明色素）可用蓝绿滤板（如B-7）激发。

荧光显微镜和普通显微镜的区别

荧光显微镜是利用紫外线为光源，用以照射被检验的物体，使该物体发出光源，然后在显微镜下进行对物体的观察。主要是用于免疫荧光细胞，主要是由光源、滤板系统和光学系统组成的在通过目镜和物镜的放大来观察样本的荧光图像。我们来看下这荧光显微镜和普通光学显微镜有什么样的区别。
1、在照明方式上看
荧光显微镜的照明方式一般是用落射式，也就是说光源是通过物镜来投放于试验样本上。

2、在分辨率上看
荧光显微镜利用的是紫外线做为光源，波长比较短，但是分辨率却高于普通的光学显微镜。
3、在滤光片上的不同
荧光显微镜是用了两个特殊的滤光片，在光源前用是用来滤出可见光，在物镜和目镜之间的使用来滤出紫外线，这样可以保护人的眼睛。
荧光显微镜也属于光学显微镜的一种，主要是银光显微镜所激发的波长短，所以这才导致了荧光显微镜和普通显微镜杂结构构造和使用上的不同，荧光显微镜大都有良好的捕捉弱光的功能，所以在极其微弱的荧光下，它的成像能力也和好。再加上近年来对荧光显微镜的不断改善，噪音也大幅度降低。因此越来越多的荧光显微镜得到应用。
以上是关于荧光显微镜和普通光学显微镜的区别，了解这些以后，在鉴别是不是荧光显微镜会有很大的帮助。

荧光显微镜与普通光学显微镜区别及特性
荧光显微镜与普通光学显微镜不同，它不是通过普通光源的照明观察标本，而是利用定波长的光(通常是紫外光、蓝紫光)激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发射荧光，所以，荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，不是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。由此可知，荧光显微镜的特点，主要是它的光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质能获得必要强度的激发光。同时，荧光显微镜必须具备相应的滤光镜系统。荧光显微镜是**荧光组织化学的基本工具。它是由超压光源、滤片系统(包括激发和压制滤板)、光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用定波长的光激发标本发射荧光。
1.激发荧光的方式：按光的波长范围分为UV激发法(使用紫外线照明法)和BV激发法(使用蓝紫光)两种。UV激发法是用短于400nm的近紫外光进行激发。该法不存在可见的激发光，所以被观察的荧光呈现该染料固有的荧光，容易判别标本上的特异荧光和背景组织的自身荧光。
2.BV激发法：是以404nm、434nm为中心的由紫外至蓝光进行激发。该方法使用蓝光照射标本，所以荧光观察系统的截止滤光片必须使用可完全阻断蓝光并可充分通过所需绿、黄荧光的滤光片。用于荧光抗体法的荧光色素。对于激发光的大吸收波长和荧光的大发光波长比较接近，所以BV激发法使用的滤光片必须使用锐截止式滤光片。该法可用蓝光作为激发光，所以荧光色素的吸收效率较，可得到较明亮的图像。其缺点是500nm以下的荧光无法看到，而500nm以上的使整个图像显黄色。在荧光抗体法中，大多以荧光色素特有的颜色来判断其特异性，所以在讨论微妙的特异性时，上述BV激发法的缺点往往影响大。

荧光显微镜与普通光学显微镜光源的区别
荧光显微镜的光源主要采用氙弧灯或汞灯，但近年来也使用高功率LED作光源，而普通光学显微镜通常只有卤素或LED灯来照明。荧光显微镜的照明方式一般是用落射式，也就是说光源是通过物镜来投放于试验样本上，而普通光学显微镜是直接用光源照射样品，从而进行的观察。在分辨率上讲，荧光显微镜利用的是紫外线光源，波长比较短，但是分辨率却高于普通的光学显微镜。在滤光片的使用上，荧光显微镜是用了两个特殊的滤光片，在光源前的作用是用来滤出可见光，在物镜和目镜之间的作用是用来滤出紫外线，以保护观察者的眼睛。荧光显微镜与普通光学显微镜的区别大致就是这些。

荧光显微镜使用方法

1、用窗帘遮蔽光线，关闭房间内的电灯，除去荧光显微镜的防尘罩，确保荧光显微镜灯室通风良好、无遮盖。装上汞灯灯箱，并转动灯箱卡圈上的拨杆，将灯箱与镜臂连接。
2、将汞灯灯箱的电源插头插入荧光电源箱后的插座，再将荧光电源箱的插头插入220V外接电源。
3、打开荧光显微镜电源开关，电压表显示出电源电压，如电源电压波动不大于额定电压值的5%，即可按下启动开关点燃汞灯，如因天气太冷或电压不稳定等原因，一次启动未点燃汞灯，可以多按几次。待超高压汞灯弧光达到稳定状态并达到Zda发光效率，即可开始工作。
4、灯泡的使用调中：
①任选一块标本放在荧光显微镜载物台上。
 ②转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移出光路，转动滤色片组转换手轮，将紫光(V)或蓝光(B)或绿光(G)激发滤色片组转入光路，并将25荧光物镜转入光路。
③调节粗微调手轮，将标本像调焦清晰。
④前后推动垂直照明器右边的聚光镜调焦推杆，使视场光栏成像清晰，转动视场光栏拨杆将视场光栏收小，调节视场光栏调中螺钉使视场光栏居中，然后再将视场光栏开至Zda。
⑤转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移入光路，前后调节灯箱上的聚光镜拨杆，使汞灯的弧光在视场内成像清晰。
⑥调整灯箱上的灯泡水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使汞灯的弧光居中。
⑦调整反光镜水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使光源的反射像与汞灯的弧光分开。
⑧转动聚光镜旋钮把聚光镜移出光路，此时视场照明均匀。
5、荧光显微镜使用过程中荧光观察：
①将荧光染色标本放到荧光显微镜载物台上。
②将10x平场物镜或25x荧光物镜转入光路，调节载物台纵横移动手轮，将标本移入光路。
③转动滤光片转换拨轮，将荧光染色标本所需要的激发滤光片组转入光路。激发滤光片组编号刻在滤片组转换拨轮上。滤光片选择正确与否，是荧光显微镜能否得到正确应用的关键。选用滤光片时，必须遵守斯托克斯定律：激发滤光片的透射波长<双色束分离器的透射波长<阻断滤光片的透射波长。
④调节粗调手轮，当看清荧光图像轮廓后，再用微调手轮调焦，直至看到清晰的荧光图像。
⑤当需要得到较强的荧光图像时，可转动聚光镜旋钮把聚光镜移入光路，可获得较明亮的荧光图像。
⑥当需要使用40x或100x荧光物镜观察时，应在标本和物镜间加上甘油，油中不能有影响观察的小泡或杂质。使用时可使甘油慢慢浸润一会儿，然后轻轻左右来回转动物镜转换器以排除气泡。

6、荧光显微摄影
由于荧光图像一般均较明场观察暗得多，所以进行荧光显微摄影需要较长的曝光时间，在曝光时应注意避免荧光显微镜震动。为了缩短曝光时间，可选择倍率较低的摄影目镜或感光度较高的摄影胶片如ASA200以上或DIN24以上。
荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。

7、荧光图像的记录方法
荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上是可靠的。
8、荧光显微镜使用结束，关闭电源，做好镜头和载物台的清洁工作，待灯室冷却至室温后，用防尘罩盖好显微镜，并做好使用记录。

荧光显微镜使用步骤

1.关闭房间内的电灯，开启显微镜汞灯；
2.根据样品标记的荧光素选择相应的滤光片；
3.放好样品，找到合适的视野；
4.如需拍照，请确认照相机内已装好彩色胶卷（zui好使用27定胶卷）；
5.开启自拍装置，选择手动档，通常拍摄速度在0.5-10秒内；
6.使用结束，关闭电源并做好使用记录。

荧光显微镜使用注意事项

1、严格按照荧光显微镜说明书要求进行操作，不要随意改变程序。
2、荧光显微镜应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。
3、防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。
4、检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱;标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱;所以，Z多不得超过2～3h。
5、荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。中应避免数次点燃光源。
6、标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。
7、荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“-”表示无或可见微弱荧光。“+”表示仅能见明确可见的荧光。“++”表示可见有明亮的荧光。“+++”表示可见耀眼的荧光。
8、其它注意事项、荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。