荧光蛋白是如何发光的吗？

荧光蛋白是如何发光的吗？

荧光蛋白（FPs）于50多年前被发现，当时发现了绿色荧光蛋白（GFP），这是一种来自维多利亚水母的蛋白质。自从发现以来，荧光蛋白家族不断扩大，有数百种变体可用。请继续阅读，以熟悉可用的FP发射颜色，并在为即将到来的实验选择荧光蛋白（或两个）时记住10点。

荧光是吸收光的物质发射的光。发射的光的波长比激发波长长。因此，FPs是具有这种独特能力的蛋白质。

当在大多数生物体中异位表达时，许多这些FP是荧光的。此外，将FP融合到另一种蛋白质通常不会影响其荧光。因此，FP用于研究许多生物学问题。两个zui常见的用途是：1）测试特定系统中的表达水平（通过测量荧光强度）;2）可视化FP的定位（融合到感兴趣的蛋白质），从而跟踪活细胞内生物分子的定位。

荧光蛋白按发射颜色（发射波长范围）分类

荧光蛋白通常按发射颜色分类，如下所述（或发射波长范围）。通过突变GFP，衍生了蓝色FP（BFP），青色FP（CFP）和黄色FP（YFP）的变体。有关GFP的细分，它是变体及其相关突变，请查看Marcy上周在GFP上的帖子。此外，在其他生物体中还发现了许多其他FP。

蓝:424 - 467  nm

青色: 474 - 492  nm

绿: 499 - 519 nm

黄色: 524 - 538  nm

橙: 559 - 572 nm

红: 574 - 610 nm

远红: 625 - 659 nm

红外线: ≥ 670 nm

独特的荧光蛋白类别

光活性/光转换：当这些蛋白质被特定的激发波长激活时，它们可以改变它们的颜色。这意味着发射波长可以改变。在少数情况下，蛋白质的初始状态是非荧光的，因此允许非常低的背景水平的荧光。这种光可解或光可转换蛋白质的例子是PA-GFP，Dendra2和meEOS蛋白。一些蛋白质是可逆可切换的（例如rsEGFP，Dreiklang）。

荧光定时器（FT）：这些蛋白质会随时间改变其颜色。因此，这些可以用作激活后细胞过程的“计时器”。四个主要的FT称为慢FT，中FT，Fast-FT和mK-GO。

大斯托克斯位移（LSS）：斯托克斯位移（以George G. Stokes命名）是波长从激发到发射的转变。对于大多数FP，斯托克斯位移小于50nm（通常要小得多）。对于LSS蛋白，斯托克斯位移≥100nm。具体来说，这些蛋白质被紫外线或蓝光激发，它们的发射是绿光或红光。例如，T-Sapphire、LSSmOrange 和 LSSmKate。

荧光传感器：这些FP会根据环境变化（例如pH，Ca）改变其激发/发射行为2+助焊剂等）。zui常用的是GECI - 遗传编码的钙指示剂（例如GCaMP）。其他包括：pHluorin & pHTomato（pH传感器），HyPer（H2O2传感器）、ArcLight（电压传感器）和 iGluSnFr（谷氨酸传感器）。这些生物传感器的更多例子可以在Addgene上找到。

分裂FP - 一些FP（例如GFP，Venus）可以分成两半，它们本身是非荧光的。如果两半非常接近，它们将形成完整的FP和荧光。分裂FP可用于确定融合到分裂FP一半的两种蛋白质的接近程度。这种技术也被称为双分子荧光互补（BiFC）。

选择荧光蛋白时要记住的8点

激励和发射（ex/em）：

每个荧光蛋白都有其独特的ex/em峰值。因此，请选择系统可以激发的荧光蛋白，并检测发射。例如，如果您的显微镜只有两个激光器，分别为488nm和561nm，您将无法使用远红荧光蛋白。如果您没有将蓝光传递到探测器/相机的过滤器，那么BFP对您毫无用处。

当使用多个荧光蛋白时，请确保它们的发射光在波长上不重叠。在许多显微镜中，滤光片不够窄，无法区分密切相关的颜色。此外，大多数FP具有广泛的发射范围，可以通过更长波长的滤光片检测到（例如，GFP也发出黄光）。

请注意，FPs的某些组合会导致称为FRET（荧光[或Förster]共振能量转移）的效应。当来自一个FP（例如CFP）的能量转移激发另一个FP（例如YFP）的荧光时，就会发生FRET。FRET仅在两个FP之间的距离<10nm时发生，并且在标记相互作用的蛋白质时应考虑。事实上，FRET通常用于确定两种蛋白质是否相互作用。

齐聚：代FP容易寡聚。这可能会影响FP融合蛋白的生物学功能。因此，建议使用单体FP（通常用“m”表示为蛋白质名称中的个字母，例如mCherry）。

氧：发色团在许多FP（特别是来自GFP的FP）上的成熟需要氧气。因此，这些FP不能在缺氧环境中使用。zui近，从鳗鱼中分离出的一种新的GFP被证明可以独立于氧气成熟，适合在厌氧条件下使用。

成熟时间：成熟时间是FP正确折叠并产生发色团所需的时间。这可以从翻译后的几分钟到几个小时。例如，超级文件夹GFP（sfGFP）和mNeonGFP可以在37°C下折叠<10分钟，mCherry需要约15分钟，TagRFP〜100分钟和DsRed〜10小时。

温度：FPs成熟时间和荧光强度会受到温度的影响。例如，增强型GFP（EGFP）针对37°C进行了优化，因此zui适合哺乳动物或细菌研究，而GFP不锈钢更适合酵母研究（24-30°C）。

亮度：亮度是衡量发射亮度的指标。亮度计算为蛋白质的消光系数和量子产率除以1000的乘积。在许多情况下，亮度与EGFP的亮度进行比较，EGFP设置为1。一些蛋白质非常暗淡（例如TagRFP657，其亮度为0.1），应考虑到这一点。光稳定性会受到实验参数（例如激发光强度、pH 或温度）的影响。

光：荧光分子在长时间暴露于激发光后被漂白（即失去发光的能力）。光稳定性可以短至100ms（EBFP）或长达1小时（mAmetrine1.2）。但是，对于大多数FP，它是几秒钟到几分钟。光稳定性可能受实验参数（例如激发光强度、pH 值或温度）的影响。

pH 稳定性：如果您计划在酸性环境中表达FP（例如，微酸性酵母细胞质基质或突触囊泡），则此参数很重要。一些FP具有不同的ex/em光谱（例如mKeima）或随着pH值的变化而改变荧光强度（例如pHluorin，pHTomato）。

为什么选择绿色荧光蛋白？

GFP是一种约27 kDa的蛋白质，由来自维多利亚水母的238个氨基酸组成。它在可见光谱的绿色部分具有荧光发射波长（因此得名），这是由于由蛋白质中心（Ser65，Tyr66和Gly67）的三个特定氨基酸的成熟反应形成的发色团。当被发现时，GFPzui令人惊讶的方面之一是发色团自发形成，没有额外的辅助因子，底物或酶活性 - 它只需要在成熟过程中存在氧气。这意味着蛋白质可以直接从维多利亚甲壳虫中获取，并在任何生物体中表达，同时仍然保持荧光。

蛋白质结构于1996年报道，是一种含有11 β片的“桶”形状，发色团隐藏在结构的中心，不受水溶剂的淬火。这种紧密排列的结构解释了整个GFP蛋白的重要性，这几乎完全是维持荧光活性所必需的;截断是可以容忍的，但是，点突变是可以接受的。与当时的传统荧光染料相比，GFP的主要优势在于它是无毒的，可以在活细胞中表达，从而能够研究动态的生理过程。