荧光蛋白激发光源用于棉花功能基因筛选

河南大学研究人员将LUYOR-3415RG荧光蛋白激发光源用于棉花功能基因筛选和视觉标记

2022年初，河南大学在《Front Plant Sci.》期刊发表文献《Optimizing the Protein Fluorescence Reporting System for Somatic Embryogenesis Regeneration Screening and Visual Labeling of Functional Genes in Cotton》，文献中指出利用LUYOR-3415荧光蛋白激发光源能够棉花基因的筛选。　　

蛋白质荧光报告系统对于深入的生命科学研究至关重要，为体内微观生物活性的可视化提供了系统的标记工具，并彻底改变了基础研究。棉花体细胞再生效率低，造成棉花转化困难。有利于利用荧光报告系统筛选转基因体细胞胚胎。　　

然而，目前棉花中可用的荧光标记系统有限。为了优化棉花的荧光报告系统，扩大可用荧光蛋白的范围，河南大学棉花实验室选择了11种荧光蛋白，涵盖红色、绿色、黄色和青色荧光颜色，并用棉花表达。除mRuby2和G3GFP外，其他9种荧光蛋白(mCherry，tdTomato，sfGFP，Clover，EYFP，YPet，mVenus，mCerulean和ECFP)在转基因愈伤组织和胚胎中稳定而强烈地表达，并在来自不同的棉花器官中遗传自筛选的胚胎。　　

此外，表达tdTomato的转基因棉花在白光下呈粉红色，不仅对愈伤组织、胚胎组织，而且对成熟植物的各种器官也呈粉红色，为棉花遗传转化过程提供了视觉标记，加速了转基因事件的评价。河南大学棉花实验室在体内构建了表达mCherry标记的转基因棉花细胞器标记物，覆盖了七个特定的亚细胞区室：质膜，内质网，土着体，线粒体，质体，高尔基体和过氧化物酶体。河南大学棉花实验室还提供了一种简单而的策略，使用细胞器标记物快速确定棉细胞中未表征蛋白质的亚细胞定位。　　

然后，河南大学棉花实验室建立了个使用气孔特异性表达启动子(ProKST1，ProGbSLSP和ProGC1)的棉花气孔荧光报告系统来驱动三叶草表达。本研究中用于转基因体细胞胚胎筛选和功能基因标记的优化荧光标记系统为加速体细胞再生效率和体内监测棉花中各种细胞过程提供了潜力。　　

用变焦立体显微镜观察转基因棉花或烟草表皮细胞的胚胎愈伤组织，雄蕊，雌蕊，叶和种子组织中的荧光(奥林巴斯，东京，日本)。用共聚焦电子显微镜观察转基因棉花原生质体，气孔细胞，纤维，叶表皮细胞和根部样品中的荧光(尼康，东京，日本)。大于 2 厘米的转基因样品2使用LUYOR-3415RG手持荧光灯(中国上海LUYOR)进行观察，并使用EOS 800D相机(佳能，中国北京)拍摄图像，并带有LUV-495A和LUV-590A荧光拍照滤镜(LUYOR)，用于绿色和红色荧光观察。使用滤光片。　　

该研究证实，LUYOR-3415RG便携式荧光蛋白激发光源能够观察GFP、eGFP、dsred、Mcherry、Tdtomato等绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的表达。

FIGURE 1 Stable expression of red and green fluorescent proteins (RFPs and GFPs, respectively) in cotton callus and embryo tissues. The protoplast of transgenic callus expression empty vector, RFP (A) and GFP (B) under white light (bright) and excitation light (fluorescence); scale bar, 20 μm. The transgenic embryo expression empty vector, RFP (C), and GFP (D) under white light (bright) and excitation light (fluorescence); scale bar, 1 mm. RFPs: mRuby2, mCherry and tdTomato; GFPs: G3GFP, sfGFP and Clover.

FIGURE 2 Red fluorescent protein (RFP) fluorescence in different tissues/organs of transgenic regenerated T0 plants. (A) Transgenic cotton plants expressing RFP during vegetative growth showed red fluorescence in their whole aerial portions under excitation spectra; scale bar, 2 cm. (B–E) The root (scale bar, 100 μm), fiber (scale bar, 50 μm), stamen/pistil (scale bar, 2 mm), and seed (scale bar, 1 mm) of transgenic regenerated cotton plants expressing empty vector and RFP under white light (bright) and excitation light (fluorescence).

FIGURE 3 Green fluorescent protein (GFP) fluorescence in different tissues/organs of transgenic regenerated T0 plants. (A) Observation of green fluorescence under excitation spectra in aerial parts of transgenic cotton plants during vegetative growth stage; scale bar, 2 cm. (B–E) The root, fiber, stamen/pistil, and seed tissues of transgenic regenerated cotton plants under white light (bright) and excitation light (fluorescence). Scale bars (white) are defined in images. (F) Measurement of GFP in young and old leaf of transgenic cotton expressing Clover by western blot.

文献全文下载地址：https://doi.org/10.3389/fpls.2021.825212  

河南大学棉花生物学重点实验室

棉花生物学重点实验室于2011年10月批准成立，依托单位为河南大学和中国农业科学院棉花研究所。2014年1月通过建设期验收。2017年6月通过科技部轮五年评估，评估结果为“良好”。现有固定人员30人，包括杰青1人，百千万人才工程入选者3人、国务院特殊津贴获得者3人，中科院百人计划专家1人，中原学者1人，中原-基础研究领军人才1人，河南省专家3人，河南大学“杰出人才特区支持计划”及攀登计划等校级特聘教授12人。在研自然科学基金重点项目、重点研发计划等科研27项，科研经费3264.4万元。 2019年发表SCI论文51篇，申请专利4项。

实验室主要围绕棉花生物学重大科学问题开展基础和应用基础研究工作，为棉花基础创新提供源动力，为棉花重大前沿问题的解决提供支撑，为棉花高层次科研人才培养和交流提供平台。主要研究方向包括：一、棉花基因组学及遗传多样性研究；二、棉花品质生物学及功能基因研究；三、棉花产量生物学及遗传改良研究；四、棉花逆境生物学及环境调控研究。

实验室拥有“作物光高效利用及耐逆多基因聚合分子设计育种”河南省科技创新团队，“农业昆虫与害虫防治”和“水分胁迫与植物次生代谢调控”两个河南省高校科技创新团队。

拥有引智平台1个（作物逆境生物学创新引智基地，“111计划”）、省级引智平台1个（河南省植物逆境多组学创新引智基地）和省级联合实验室1个（河南省作物逆境多组学联合实验室）和“河南大学-亚伯大学多组学创新基地“，兼职工作的外籍专家包括美国科学院院士Alexander S. Raikhel教授等20余位学术大师和学术骨干。