荧光显微镜的原理和操作步骤

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荧光显微镜的原理是什么?

与普通光学显微镜不同，荧光显微镜不是通过普通光源的照射来观察标本，而是利用一定波长的光（通常是紫外光、蓝紫光）在显微镜下激发标本中的荧光物质发出荧光，所以，荧光显微镜光源的作用不是直接照射，而是作为能量源激发标本内部的荧光物质。我们之所以能观察到标本，是由于光源的照射，而是标本中的荧光物质吸收激发光能后呈现的荧光现象。

由此可见，荧光显微镜的主要特点是它的光源可以在特定波长范围内提供大量的激发光，使被测样品中的荧光物质能够获得被测物的激发光。必要的强度。同时，荧光显微镜必须有相应的滤光系统。

荧光显微镜是免疫荧光组织化学的重要工具。它由超高压光源、滤光系统（包括激发和加压滤板）、光学系统和照相系统等主要部件组成。它利用一定波长的光激发标本发射荧光。

激发荧光的方式：根据光的波长范围分为UV激发法（使用紫外照射法）和BV激发法（使用蓝紫光）。紫外激发法使用短于 400 nm 的近紫外光进行激发。该方法没有可见的激发光，因此观察到的荧光表现出染料的固有荧光，很容易区分标本上的特异性荧光和背景组织的自发荧光。

BV激发法是从紫外光激发到以404nm和434nm为中心的蓝光。这种方法使用蓝光照射标本，因此荧光观察系统的截止滤光片必须使用能够完全阻挡蓝光并完全通过所需的绿色和黄色荧光的滤光片。用于荧光抗体测定的荧光染料。激发光的*大吸收波长与荧光的*大发射波长比较接近，所以BV激发法中使用的滤光片必须使用锐截止滤光片。该方法可以使用蓝光作为激发光，因此荧光染料的吸收效率高，可以获得更亮的图像。缺点是500nm以下看不到荧光，500nm以上会使整个图像呈现黄色。在荧光抗体法中，大部分荧光染料都是独特的。因此，在讨论细微特异性时，上述 BV 激发方法的缺点往往影响很大。

综上所述，荧光显微镜的照明根据聚光镜的结构和激发光的波长可以分为以下三点。

1.从荧光图像的对比度要求来看，紫外激发的暗场聚光镜*适合照明。

2.考虑到图像的亮度，BV激发滤光片的暗场观察效率*高。

3.UV激发滤光片暗场观察和BV激发暗场聚光镜照明的特点可以说是介于这两种照明方式之间，但前者的滤光片暗场特性更强，显示的图像更亮，对比度小；后者保留了暗场光路的特性，因此显示图像更暗，对比度提高。实际使用荧光显微镜时，应使用*适合标本要求的照明方法进行观察。

必须指出的是，即使是用对比度*好的紫外激发暗场聚光器照射时，被试样折射或散射的部分紫外激发光也会进入物镜，使加胶面和光学玻璃中的加胶面光学系统会受到激发的影响，产生的自发荧光会使图像的响应变差。因此，必须在目镜前使用吸收紫外线的滤光片作为截止滤光片。

 荧光显微镜的基本操作步骤

1.安装紫外线防护罩。

2.打开高压汞灯电源控制箱开关。本文来自检验条网

3.插入遮光罩以中断光路。

4.预热5-10分钟。

5.将载有样品的载玻片放在载物台上。

6.选择物镜（按先低倍，后高倍的顺序）。

7.转动分光镜组件转盘，选择需要的分光镜组件：“O”为观察透射光； “WU”用于观察蓝色荧光（如DAP1）； “WB”用于观察绿色荧光（如FITC）； “WG”用于观察红色荧光（如TRITC）。

8.使用阻塞滤光片（目前大多数阻塞滤光片都内置在荧光显微镜中）。

9.通过粗细螺旋调节焦距。

10.打开连接显微镜的电脑，点击数字成像系统软件，采集数字图像。

荧光显微镜的注意事项

1.由于荧光观察所用的光源是高压汞灯，发出的光中含有紫外线，对人眼有害，所以必须加装紫外线防护罩。本文来自巡检区网

2.为延长水银灯的使用寿命，水银灯打开后不能立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要15分钟才能关闭。

3.水银灯熄灭后，待完全冷却后再重新启动。否则，灯内的水银蒸气还没有恢复到液态，内阻极小。如果再次施加电压，会造成短路，导致汞灯爆炸。这不仅会损坏电器，更重要的是，汞蒸气会溢出，从而导致工作室受到污染。因此，关闭水银灯后，不能立即再次开启，必须至少等待 30 分钟。

4.高压水银灯工作时放出大量热量。因此工作环境温度不宜过高，必须有良好的散热条件。

5.汞灯的使用寿命约为200-300小时。电源控制箱上有一个时间累积计数器。用户需要记录累计小时数，当达到300小时时，需要更换新灯泡，否则亮度不够，影响观察。

荧光显微镜标本制作特点及观察要求

1.幻灯片：幻灯片的厚度应该是0.在 8mm 到 1.2mm 之间，载玻片太厚，无法吸收更多的光，激发光难以聚集在标本上。载玻片必须光滑、厚度均匀且没有明显的自发荧光。有时使用石英玻璃载玻片。

2.盖板玻璃：盖板玻璃的厚度应在0.17mm左右，光滑、干净。为了增强激发光，也可以使用干涉盖玻片。这种特殊的盖板玻璃表面镀有几层物质（如氟化镁），对不同波长的光有不同的干涉作用，可以使荧光顺利通过和反射。激发光，这种反射的激发光激发样品中的荧光。

3.标本：组织切片或其他标本不宜太厚，一般5-20pm。太厚的切片会导致大部分激发光在试样下部被消耗，而物镜直接观察到的试样上部不能被激发。切片折叠或杂质过多会影响荧光观察。

4.封固剂：封固剂必须无自发荧光，五色透明。添加防淬火剂后，用指甲油（实际使用中，指甲油密封效果很好，可以薄而均匀）将盖板玻璃密封在其周围，这样不仅可以防止盖板玻璃滑动，还能防止抗衰老。猝灭剂蒸发。在没有抗淬灭剂的情况下，也可以使用含30%甘油的PBS，或等量的甘油和0.5mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.0-9.5）的混合物封片。

5.镜片的清洁：油性镜片使用后，需要用无水乙醇或3：7酒精醚混合物擦拭镜片纸。

6.及时观察：染色后的标本要及时观察，因为时间长了荧光会逐渐减弱。如果将标本存放在 4°C 的聚乙烯塑料袋中，可以延迟荧光衰减时间。