近红外荧光蛋白的优点

近红外荧光蛋白是绿色荧光蛋白同源的一类荧光蛋白，可利用自身特殊的结构催化形成生色团，且具备许多优良的特点：
(1)易于检测，灵敏度高，荧光性质稳定。荧光蛋白生色团的成熟不需要添加底物或其他辅助因子，仅在激发光激发下就能发出荧光，单细胞标记清晰，荧光显微镜下很容易观察到；
(2)荧光蛋白基因编码序列短，易构建载体；
(3)细胞毒性小，可直接标记活细胞或活体组织；
(4)相比于 GFP，它的激发光和发射光波长更长，位于近红光区(650~900 nm)，在动物组织中光吸收和光散射较低，有较高的穿透性[22]，更适宜于动物活体组织的深层成像，是活体成像更为理想的荧光标记分子。
本研究使用的近红外荧光蛋白 iRFP682 的激发光和发射光波长分别为 663 nm 和 682 nm，是单体荧光蛋白分子，其发光性质较为稳定，较长的光谱特点使其在活体动物组织成像的应用中更具潜力。

荧光蛋白作为标记分子在生命科学的发展中发挥了重要作用。荧光蛋白具备良好的性能，其在发挥标记分子的作用中相比于传统的生物标记分子有诸多优良特点，不需要额外的底物或辅助因子，仅在蓝光或紫外激发下即可发出明亮的荧光，检测方便且灵敏性高。荧光蛋白独特的发光特性使其广泛应用于动物、植物、微生物等的研究中，涉及分子水平、细胞水平，再到动物活体或全身成像等。

近红外荧光蛋白（Near-infrared fluorescent protein，iRFP）是绿色荧光蛋白同源的一类荧光蛋白，具备绿色荧光蛋白的发光优点。但是，相比于GFP，它的激发光和发射光波长更长，位于近红光区（650~900nm），在动物组织中光吸收和光散射较低，有较高的穿透性，更适宜于动物活体组织的深层成像，是深层成像更为理想的荧光标记分子。

本文使用的iRFP713的激发光和发射光波长分别为690nm和713nm，是单体荧光蛋白分子，其发光性质较为稳定，较长的光谱特点使其在活体动物组织成像的应用中更具潜力。 腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是一种线性的单链DNA的微小病毒，分子量小，是当前zui受欢迎的基因载体之一。AAV的基因组中有三个重要的结构：ITR序列，Rep和Cap基因，ITR是AAV DNA两端的倒置末端重复序列，是腺相关病毒载体不可或缺的顺式作用元件。ITR自我互补形成倒T型结构，能维持基因组稳定，使外源基因能够在细胞及动物许多组织中长期稳定有效地表达。腺相关病毒无病原性，一般不会致病，不会产生细胞内免疫反应和细胞毒性，对生物机体安全，是较为安全的病毒载体。 本论文通过分子克隆等手段将iRFP713基因克隆到含AAV2的ITR序列的质粒载体上构建重组真核表达载体pAAV-iRFP713。pAAV-iRFP713质粒和pDG质粒共转染AAV-293细胞后，利用pAAV-iRFP713质粒提供AAV2病毒所必须的ITR序列，辅助质粒pDG提供AAV2重组复制、包装病毒外壳等所必须的Rep和Cap基因，在宿主细胞内包装携带iRFP713基因的重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus, rAAV ) rAAV-iRFP713。72h后收集重组病毒并分离浓缩纯化，经实时荧光定量PCR测定其拷贝数即物理滴度。 携带近红外荧光蛋白基因的重组表达质粒载体和重组病毒载体体外转染细胞后，在多种细胞中均能成功表达，细胞标记效果良好。为了检验iRFP713在动物组织中的表达和成像效果，将重组病毒注射小鼠骨骼肌，在两天，一周、两周、一个月时在近红外荧光活体成像系统观察到荧光信号，表明腺相关病毒载体能携带近红外荧光蛋白长期稳定表达。 综合上述，iRFP713基因表达稳定，荧光信号强，是良好的细胞标记分子。重组腺相关病毒携带iRFP713在小鼠骨骼肌中能长久有效稳定的表达。此外，利用腺相关病毒的定点整合特性，我们将建立一株稳定表达iRFP713的乳腺癌细胞株。随着研究的进一步进行，iRFP将在动物肿瘤模型等活体动物组织成像的研究应用中表现更为优越。